生防菌Y13的定殖与诱导油茶系统抗性研究
1 生防菌Y13定殖的研究
1.1标记菌株Y13-GFP 菌悬液的制备
将Y13-GFP 在LB 培养液中培养至对数期, 离心收集菌体, 生理盐水冲洗3次, 用无菌水调节至菌体浓度为1×109 cfu/mL。
1.2盆栽试验设计
选用两年生健康油茶苗，移栽于花盆中，15天后将10ml 的Y13-GFP 菌悬液均勾地加入到植株的根围, 对照以清水代替菌悬液。接种后, 分别于1d 、3d 、5d 、7d 、15d 、30d 、60d 、90d 、120d 、150d 、180d 、210d 、240d 、270d 、300d 、330d 、360d 取根、根际土壤、叶片进行分析。
1.3标记菌株Y13-GFP 的回收与检测
根际土壤：取样时, 将油茶幼苗根系的土体土壤轻轻抖落, 取根际土壤, 按梯度稀释计数法待菌落长出以后在荧光显微镜下计发光菌落数。
根：用无菌水小心将油茶根系的土壤全部洗掉后, 用75 %的酒精消毒3 min,再用2 %的NaClO 消毒10 min,最后用无菌水漂洗6次。取最后一遍漂洗的无菌水涂于LB 平板上以检测消毒是否完全。在无菌条件下, 将消毒过的根系用研钵磨碎后, 再在摇床上振荡10 min,梯度稀释涂布平板, 每个处理重复3次,30 °C 培养48 h, 用荧光显微镜观察计算发光菌落数, 测定其定殖情况。
叶：同1.3。
1.4数据处理
2 生防菌Y13诱导油茶对炭疽病的系统抗性研究
2.1生防菌Y13对油茶炭疽病菌在油茶叶面定殖的影响
2.1.1油茶叶片组织和炭疽病菌DNA 的提取
2.1.2生防菌Y13菌悬液和病原菌孢子悬液的制备
将Y13接种到液体LB 培养基中,30 °C,180 rpm/min培养16小时, 将菌液常温下4500 rpm离心10分钟, 倒去上清液, 用无菌水悬浮菌体, 将菌体浓度稀释到1xlO9cfu/mL, 用无菌水稀释至1xlO9cfu/mL。
油茶炭疽菌接种到PDA 固体培养基上, 置于30 °C 培养箱培养4-5天后取出, 用无菌水将平板上的分生孢子洗脱下来, 后通过4层纱布滤去菌丝及部分固体培养基, 将配制好的孢子悬液通过血球计数板计算孢子数量, 并用无菌水配制成浓度为1xlO6cfu/mL的孢子悬液。
2.1.3生防菌Y13的处理以及病原菌的侵染
生防菌处理一：将制备好的Y13菌悬液接种到油茶的根部(10mL/株）。
生防菌处理二：将制备好的Y13菌悬液均匀喷雾至油茶的叶面(5mL/株）。
将处理后的油茶置于温室培养7d ，将制备好的病原菌孢子悬液用移液枪加到油茶叶面上, 每张叶面5个侵染位点, 每个侵染位点滴加10 ul的孢子悬液, 将处理后的植株转移到温室,100%的湿度,28 °C 的侵染温度。
2.1.4病变组织及病变周围组织的采样
病变组织一般出现在侵染后的3-4天, 因此选择4dpi,6dpi, 8dpi,10dpi和12dpi (dpi=侵染后天数) 这5个时间点来釆样, 从同一处理的3株植株的叶片, 分别取病变组织, 称取约1克的病变组织提取组织DNA 。
病变周围组织的取样选取3dpi,5dpi, 7dpi, 9dpi和11dpi 5个时间点来采样。由于病变组织的大小随着侵染的时间不断增大, 有必要设计2个模子, 大小根据病斑的情况来确定，在3dpi,
5dpi 的时间点用较小的模子来获得大小均一的组织叶片,7dpi,9dpi, 11dpi 的时间点用较大的模子来获取组织样品。将获取的组织样品中病变组织小心的用小刀去掉, 剩余的病变周围组织的样品称取1克提取组织
DNA 。
2.1.5病原菌孢子的萌发实验
将病原菌孢子悬液稀释到1xlO3cfu/mL后, 用移液枪吸取0.1mL 均匀地涂布到玻片上, 置于培养箱(100 %湿度,28 °C) 进行萌发, 分别取12,18,24, 30小时的样品在显微镜下观察孢子的萌发过程。
2.1.6病变组织及病变周围组织的DNA 提取
采用 CTAB 方法提取样品基因组总DNA 。
2.1.7实时荧光定量PCR
2.1.8病变组织大小的测量, 分生孢子的分离以及附着胞在病变组织的观察
将接种炭疽菌的植株在温室培养2周后, 首先用游标卡尺测量在不同处理叶面的病变组织的直径大小, 然后转移至人工气候调节室3天后取出, 从叶片中取1厘米见方的病变组织, 至于10 ml 的无菌水的离心管内, 在涡旋仪上充分混和, 吸取100 uL稀释涂布在PDA 平板上, 置于30 °C 培养箱内,7-10天后统计菌落数。将不同处理的病变组织置于显微镜下观察附着胞的数量。
2.1.9数据分析
2.2生防菌Y13诱导油茶获得系统抗性研究
2.2.1生防菌Y13的处理以及病原菌的侵染
同2.1.3
2.2.2植物组织RNA 的提取和cDNA 旳合成
选取在炭疽菌侵染后的1,2,3天三个时间点取样, 分别从接种病原菌的油茶叶片取1g 进行样品制备。采用RNeasy@ PlantMini Kit(QIAGEN, USA) 试剂盒提取油茶叶片组织RNA, 按照 SuperScriptTM III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(InvitrogenTM, USA)反转录试剂盒进行cDNA 的合成。由于油茶叶片组织的纤维、次级代谢物的含量较高, 因此选择嫩的叶片进行RNA 的提取, 在液氮碾磨时, 在碾钵中加入一些玻璃硅粉末来对植物组织的充分碾磨。cDNA 统一由1000ng 的油茶RNA 合成。
2.2.3实时荧光定量PCR
2.2.4油茶叶片质外体液(Apoplastic fluid)的提取及蛋白的定量
采用生防菌处理一与生防菌处理二对油茶植株进行诱导，6天后接种炭疽病菌, 在3dpi 时分别取不同处理的植株3张叶片, 置于含有150 mM NaCl和25
mM MES的缓冲溶液的过滤瓶中, 抽真空15分钟左右, 将缓冲液压入植物组织。然后将样品取出, 用滤纸吸取表面的缓冲液, 将叶片置于无菌针管中, 针头处接一
1.5mL 离心管, 然后将其置于50mL 离心管中,3500 rpm,4 °C 离心10分钟, 叶子的质外体液就离心到了1.5mL 离心管内, 将其在-70 °C 冰箱中保存待用。油茶叶片的质外体液蛋白含量的定量采用Bio-Rad protein assay kit(Bio-Rad,Hercules, CA)蛋白检测试剂盒进行蛋白含量的测定。蛋白含量的标准曲线制作根据牛血清蛋白 Bovine serum albumin。
2.2.5荧光次级代谢产物的检测
将不同处理的病原菌侵染二周的油茶叶片取下, 在紫外灯下观察荧光酚类次级代谢产物在植物病变组织的分布和亮度。
2.2.6生防菌Y13 IAA旳测定
细菌的IAA 的测定方法依照(Brie et al., 1991)。将待测细菌在含有3 mM色氧酸的LB 液体培养基中培养48小时, 将菌液3000 rpm 离心30分钟, 取2 ml 上清液, 加入100 的磷酸和4 mL 的Solawaski's 试剂(50 mL 35%的高氯酸；1 mL 0.5M三氯化铁) 在室温下混合30分钟。IAA 的
含量与反应液粉红颜色成正比, 所得溶液在535nm 处检测起吸光值。IAA 的标准曲线根据纯IAA 作出。
2.2.7几丁质酶的测定
几丁质酶(CHT)提取与活性测定参照刘凤权等(2003)和EI 等(2003)方法, 并稍作修改，取0.2g 油茶叶片组织, 剪碎后放入预冷的研钵中, 加入7mL 预冷的0.1mol/L的醋酸缓冲液中(pH5.8),研磨匀浆,4 °C13000rpm 离心30min 后, 上清液即为粗酶液。1.2mL 反应体系中含0.4mL 1mol/L的醋酸缓冲液,0.4mL 的1%的胶体几丁质和0.4mL 的粗提酶液,40°C 反应lh 后,5000rpm 离心5min 。上清液中N 一乙酰葡糖胺含量的测定是在0.4mL 上清液中加入0.2mL 饱和硼砂溶液, 沸水中煮7min, 冷却后加2mL 冰醋酸和1mL l%对二甲氨基苯甲醛(DMAB)溶液,37°C 保温15min, 测定OD585值。以每秒水解几丁质产生1nmol N-乙酞葡糖胺为一个酶活单位(U)。
2.2.8 β-1,3葡聚糖酶的测定
β-1,3葡聚糖酶提取与活性测定参照(葛秀春等,2002) 和Abeles et al.(1971)方法，并稍作修改。酶液与等体积4%昆布多糖在40°C 反应10min ，产生的葡萄糖用3倍体积的二硝基水杨酸试剂显色，水稀释后测定OD556。用葡萄糖作标准曲线, 以10min 内产生1umol 葡萄糖的酶量为一个酶单位。
2.2.9数据处理
3 生防菌Y13对激活油茶抗病激素免疫调控的研究
3.1植物组织RNA 的提取和cDNA 的合成
选择在病原菌侵染后3dpi 的时间点取样进行样品的制备。采用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, USA) 试剂盒提取油茶叶片组织RNA, 按照 superscriptTM III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(InvitrogenTM, USA)反转录试剂盒进行cDNA 的合成。cDNA 统一由500ng 的油茶RNA 合成。
3.2 PCR
3.3生防菌Y13以及化学物质的处理以及病原菌的侵染
生防菌处理一：将制备好的Y13菌悬液接种到油茶的根部(10mL/株）。
生防菌处理二：将制备好的Y13菌悬液均匀喷雾至油茶的叶面(5mL/株）。
用浓度为 50 ug/mL 的 Actigard 50WG Fungicide(Syngenta, Greensboro, NC) 来代替Acibenzolar-s-methyl 来诱导NahG （由于体内编码了水杨酸水解酶基因导致突变子对水杨酸信号途径不敏感, 水杨酸信号途径相关PR 蛋白的不表达）。
将 2 mM 的Probenazole (PBZ)溶解在0.1M 的磷酸缓冲溶液中, 加入0.01%的trution X-100的混合溶液来诱导nprI-1（缺失了基因, 它在SA 下游作用, 启动SAR 相关基因PR-1和PR-5的表达, 对SA 和JA 途径之间的调节起着很重要的作用, 近来的研究发现, 基因可能直接参与PR 基因的转录调控。因此突变子不能诱导PR 蛋白的表达）。
用75uM 浓度的茉莉酸甲酯(MeJa)处理jarl-1突变体（缺失了茉莉酰胺合成酶基因, 导致了突变子对茉莉酸信号途径的不敏感, 不能诱导茉莉酸/乙烯途径相关蛋白PDF1.2的表达）。 1mM 的 2-chloroethylphosphonic acid 来处理 ein2-l 突变体（对乙稀信号途径下游CTR1基因的缺失, 导致了突变子对乙稀信号途径的不敏感, 不能诱导PDF7.2的表达）。
所有的化学诱导溶液都用气溶胶喷雾器对植株进行处理。
进行生防菌及化学物质的诱导处理，诱导6天后接种病原菌, 将5uL 的孢子悬液用移液枪转移至油茶叶片的边缘, 每片叶子接种2次, 接种完后置于温度18±2 °C, 相对湿度100%人工气候室中培养3-4天后取出, 并转移至温室继续培养。
3.4生防菌菌悬液和病原菌抱子悬液的制备
同2.1.2
3.5数据分析
对生防菌Y13对油茶不同激素诱导系统突变子的诱导抗性进行研究，目的是利用油茶的不同激素途径的突变子(NahG,nprI-1,jarl-1,ein2-l)来研究生防菌Y13依赖何种激素途径诱导植物产生抗性。
生防菌Y13的定殖与诱导油茶系统抗性研究
1 生防菌Y13定殖的研究
1.1标记菌株Y13-GFP 菌悬液的制备
将Y13-GFP 在LB 培养液中培养至对数期, 离心收集菌体, 生理盐水冲洗3次, 用无菌水调节至菌体浓度为1×109 cfu/mL。
1.2盆栽试验设计
选用两年生健康油茶苗，移栽于花盆中，15天后将10ml 的Y13-GFP 菌悬液均勾地加入到植株的根围, 对照以清水代替菌悬液。接种后, 分别于1d 、3d 、5d 、7d 、15d 、30d 、60d 、90d 、120d 、150d 、180d 、210d 、240d 、270d 、300d 、330d 、360d 取根、根际土壤、叶片进行分析。
1.3标记菌株Y13-GFP 的回收与检测
根际土壤：取样时, 将油茶幼苗根系的土体土壤轻轻抖落, 取根际土壤, 按梯度稀释计数法待菌落长出以后在荧光显微镜下计发光菌落数。
根：用无菌水小心将油茶根系的土壤全部洗掉后, 用75 %的酒精消毒3 min,再用2 %的NaClO 消毒10 min,最后用无菌水漂洗6次。取最后一遍漂洗的无菌水涂于LB 平板上以检测消毒是否完全。在无菌条件下, 将消毒过的根系用研钵磨碎后, 再在摇床上振荡10 min,梯度稀释涂布平板, 每个处理重复3次,30 °C 培养48 h, 用荧光显微镜观察计算发光菌落数, 测定其定殖情况。
叶：同1.3。
1.4数据处理
2 生防菌Y13诱导油茶对炭疽病的系统抗性研究
2.1生防菌Y13对油茶炭疽病菌在油茶叶面定殖的影响
2.1.1油茶叶片组织和炭疽病菌DNA 的提取
2.1.2生防菌Y13菌悬液和病原菌孢子悬液的制备
将Y13接种到液体LB 培养基中,30 °C,180 rpm/min培养16小时, 将菌液常温下4500 rpm离心10分钟, 倒去上清液, 用无菌水悬浮菌体, 将菌体浓度稀释到1xlO9cfu/mL, 用无菌水稀释至1xlO9cfu/mL。
油茶炭疽菌接种到PDA 固体培养基上, 置于30 °C 培养箱培养4-5天后取出, 用无菌水将平板上的分生孢子洗脱下来, 后通过4层纱布滤去菌丝及部分固体培养基, 将配制好的孢子悬液通过血球计数板计算孢子数量, 并用无菌水配制成浓度为1xlO6cfu/mL的孢子悬液。
2.1.3生防菌Y13的处理以及病原菌的侵染
生防菌处理一：将制备好的Y13菌悬液接种到油茶的根部(10mL/株）。
生防菌处理二：将制备好的Y13菌悬液均匀喷雾至油茶的叶面(5mL/株）。
将处理后的油茶置于温室培养7d ，将制备好的病原菌孢子悬液用移液枪加到油茶叶面上, 每张叶面5个侵染位点, 每个侵染位点滴加10 ul的孢子悬液, 将处理后的植株转移到温室,100%的湿度,28 °C 的侵染温度。
2.1.4病变组织及病变周围组织的采样
病变组织一般出现在侵染后的3-4天, 因此选择4dpi,6dpi, 8dpi,10dpi和12dpi (dpi=侵染后天数) 这5个时间点来釆样, 从同一处理的3株植株的叶片, 分别取病变组织, 称取约1克的病变组织提取组织DNA 。
病变周围组织的取样选取3dpi,5dpi, 7dpi, 9dpi和11dpi 5个时间点来采样。由于病变组织的大小随着侵染的时间不断增大, 有必要设计2个模子, 大小根据病斑的情况来确定，在3dpi,
5dpi 的时间点用较小的模子来获得大小均一的组织叶片,7dpi,9dpi, 11dpi 的时间点用较大的模子来获取组织样品。将获取的组织样品中病变组织小心的用小刀去掉, 剩余的病变周围组织的样品称取1克提取组织
DNA 。
2.1.5病原菌孢子的萌发实验
将病原菌孢子悬液稀释到1xlO3cfu/mL后, 用移液枪吸取0.1mL 均匀地涂布到玻片上, 置于培养箱(100 %湿度,28 °C) 进行萌发, 分别取12,18,24, 30小时的样品在显微镜下观察孢子的萌发过程。
2.1.6病变组织及病变周围组织的DNA 提取
采用 CTAB 方法提取样品基因组总DNA 。
2.1.7实时荧光定量PCR
2.1.8病变组织大小的测量, 分生孢子的分离以及附着胞在病变组织的观察
将接种炭疽菌的植株在温室培养2周后, 首先用游标卡尺测量在不同处理叶面的病变组织的直径大小, 然后转移至人工气候调节室3天后取出, 从叶片中取1厘米见方的病变组织, 至于10 ml 的无菌水的离心管内, 在涡旋仪上充分混和, 吸取100 uL稀释涂布在PDA 平板上, 置于30 °C 培养箱内,7-10天后统计菌落数。将不同处理的病变组织置于显微镜下观察附着胞的数量。
2.1.9数据分析
2.2生防菌Y13诱导油茶获得系统抗性研究
2.2.1生防菌Y13的处理以及病原菌的侵染
同2.1.3
2.2.2植物组织RNA 的提取和cDNA 旳合成
选取在炭疽菌侵染后的1,2,3天三个时间点取样, 分别从接种病原菌的油茶叶片取1g 进行样品制备。采用RNeasy@ PlantMini Kit(QIAGEN, USA) 试剂盒提取油茶叶片组织RNA, 按照 SuperScriptTM III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(InvitrogenTM, USA)反转录试剂盒进行cDNA 的合成。由于油茶叶片组织的纤维、次级代谢物的含量较高, 因此选择嫩的叶片进行RNA 的提取, 在液氮碾磨时, 在碾钵中加入一些玻璃硅粉末来对植物组织的充分碾磨。cDNA 统一由1000ng 的油茶RNA 合成。
2.2.3实时荧光定量PCR
2.2.4油茶叶片质外体液(Apoplastic fluid)的提取及蛋白的定量
采用生防菌处理一与生防菌处理二对油茶植株进行诱导，6天后接种炭疽病菌, 在3dpi 时分别取不同处理的植株3张叶片, 置于含有150 mM NaCl和25
mM MES的缓冲溶液的过滤瓶中, 抽真空15分钟左右, 将缓冲液压入植物组织。然后将样品取出, 用滤纸吸取表面的缓冲液, 将叶片置于无菌针管中, 针头处接一
1.5mL 离心管, 然后将其置于50mL 离心管中,3500 rpm,4 °C 离心10分钟, 叶子的质外体液就离心到了1.5mL 离心管内, 将其在-70 °C 冰箱中保存待用。油茶叶片的质外体液蛋白含量的定量采用Bio-Rad protein assay kit(Bio-Rad,Hercules, CA)蛋白检测试剂盒进行蛋白含量的测定。蛋白含量的标准曲线制作根据牛血清蛋白 Bovine serum albumin。
2.2.5荧光次级代谢产物的检测
将不同处理的病原菌侵染二周的油茶叶片取下, 在紫外灯下观察荧光酚类次级代谢产物在植物病变组织的分布和亮度。
2.2.6生防菌Y13 IAA旳测定
细菌的IAA 的测定方法依照(Brie et al., 1991)。将待测细菌在含有3 mM色氧酸的LB 液体培养基中培养48小时, 将菌液3000 rpm 离心30分钟, 取2 ml 上清液, 加入100 的磷酸和4 mL 的Solawaski's 试剂(50 mL 35%的高氯酸；1 mL 0.5M三氯化铁) 在室温下混合30分钟。IAA 的
含量与反应液粉红颜色成正比, 所得溶液在535nm 处检测起吸光值。IAA 的标准曲线根据纯IAA 作出。
2.2.7几丁质酶的测定
几丁质酶(CHT)提取与活性测定参照刘凤权等(2003)和EI 等(2003)方法, 并稍作修改，取0.2g 油茶叶片组织, 剪碎后放入预冷的研钵中, 加入7mL 预冷的0.1mol/L的醋酸缓冲液中(pH5.8),研磨匀浆,4 °C13000rpm 离心30min 后, 上清液即为粗酶液。1.2mL 反应体系中含0.4mL 1mol/L的醋酸缓冲液,0.4mL 的1%的胶体几丁质和0.4mL 的粗提酶液,40°C 反应lh 后,5000rpm 离心5min 。上清液中N 一乙酰葡糖胺含量的测定是在0.4mL 上清液中加入0.2mL 饱和硼砂溶液, 沸水中煮7min, 冷却后加2mL 冰醋酸和1mL l%对二甲氨基苯甲醛(DMAB)溶液,37°C 保温15min, 测定OD585值。以每秒水解几丁质产生1nmol N-乙酞葡糖胺为一个酶活单位(U)。
2.2.8 β-1,3葡聚糖酶的测定
β-1,3葡聚糖酶提取与活性测定参照(葛秀春等,2002) 和Abeles et al.(1971)方法，并稍作修改。酶液与等体积4%昆布多糖在40°C 反应10min ，产生的葡萄糖用3倍体积的二硝基水杨酸试剂显色，水稀释后测定OD556。用葡萄糖作标准曲线, 以10min 内产生1umol 葡萄糖的酶量为一个酶单位。
2.2.9数据处理
3 生防菌Y13对激活油茶抗病激素免疫调控的研究
3.1植物组织RNA 的提取和cDNA 的合成
选择在病原菌侵染后3dpi 的时间点取样进行样品的制备。采用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, USA) 试剂盒提取油茶叶片组织RNA, 按照 superscriptTM III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(InvitrogenTM, USA)反转录试剂盒进行cDNA 的合成。cDNA 统一由500ng 的油茶RNA 合成。
3.2 PCR
3.3生防菌Y13以及化学物质的处理以及病原菌的侵染
生防菌处理一：将制备好的Y13菌悬液接种到油茶的根部(10mL/株）。
生防菌处理二：将制备好的Y13菌悬液均匀喷雾至油茶的叶面(5mL/株）。
用浓度为 50 ug/mL 的 Actigard 50WG Fungicide(Syngenta, Greensboro, NC) 来代替Acibenzolar-s-methyl 来诱导NahG （由于体内编码了水杨酸水解酶基因导致突变子对水杨酸信号途径不敏感, 水杨酸信号途径相关PR 蛋白的不表达）。
将 2 mM 的Probenazole (PBZ)溶解在0.1M 的磷酸缓冲溶液中, 加入0.01%的trution X-100的混合溶液来诱导nprI-1（缺失了基因, 它在SA 下游作用, 启动SAR 相关基因PR-1和PR-5的表达, 对SA 和JA 途径之间的调节起着很重要的作用, 近来的研究发现, 基因可能直接参与PR 基因的转录调控。因此突变子不能诱导PR 蛋白的表达）。
用75uM 浓度的茉莉酸甲酯(MeJa)处理jarl-1突变体（缺失了茉莉酰胺合成酶基因, 导致了突变子对茉莉酸信号途径的不敏感, 不能诱导茉莉酸/乙烯途径相关蛋白PDF1.2的表达）。 1mM 的 2-chloroethylphosphonic acid 来处理 ein2-l 突变体（对乙稀信号途径下游CTR1基因的缺失, 导致了突变子对乙稀信号途径的不敏感, 不能诱导PDF7.2的表达）。
所有的化学诱导溶液都用气溶胶喷雾器对植株进行处理。
进行生防菌及化学物质的诱导处理，诱导6天后接种病原菌, 将5uL 的孢子悬液用移液枪转移至油茶叶片的边缘, 每片叶子接种2次, 接种完后置于温度18±2 °C, 相对湿度100%人工气候室中培养3-4天后取出, 并转移至温室继续培养。
3.4生防菌菌悬液和病原菌抱子悬液的制备
同2.1.2
3.5数据分析
对生防菌Y13对油茶不同激素诱导系统突变子的诱导抗性进行研究，目的是利用油茶的不同激素途径的突变子(NahG,nprI-1,jarl-1,ein2-l)来研究生防菌Y13依赖何种激素途径诱导植物产生抗性。