基因克隆技术研究进展
刘心伟1 ,朱文豪2 ,李?? 何 3 (1.河南省体育科学研究所, 河南郑州450044;2. 河南省农科院畜牧兽医研究所, 河南郑州450002; 3.信阳职业技术学院化学工程系, 河南信阳464000)
[关键词]??基因克隆; 图位克隆; 转座子标签; 表达序列标签; 差异表达基因 [中图分类号]??Q785????????[文献标识码]??B????????[文章编号]??1008-9276(2010)06-0753-04 ???? 几种模式生物基因组测序和人类基因组计划(humangenomeprojec,tHGP)的相继完成, 使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作和序列测定, 后基因组学时代则是进行基因组功能注释(genomeannotation),这也是功能基因组学的主要研究目标 [1-2] 。如何利用基因这一重要的资源, 日益成为研究焦点。关于基因专利权的建立和完善的基因争夺大战的硝烟也正在弥漫全球。克隆化基因不仅可以用来兴旺生命科学工业(制药业等), 改良农作物、畜禽品种等, 还可以对遗传性疾病进行基因治疗, 探索疾病的分子机制和生物发育调控规律。克隆基因的途径有两种, 正向遗传学和反向遗传学途径。前者是依据目标基因所表现的功能为基础, 通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的; 后者则着眼于基因本身, 通过特定的序列或在基因组中的位置进行。基因的克隆一般采用下列技术:同源序列技术、差异表达基因分离技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和转座子标签技术等。1?? 功能性克隆 1.1??通过基因产物的克隆技术?? 在传统遗传学(正向遗传学) 占主导地位的时代, 人们以基因产物为导向来分离克隆基因(功能克隆) 。由于基因产物的结构、功能已知, 可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列, 反推其核苷酸序列, 设计探针或引物从基因组DNA 文库或cDNA 文库中筛选克隆, 也可以制 备产物抗体, 从表达载体构建的cDNA 文库中筛选相应克隆, 进而分离目的基因。 若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时, 可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法, 筛选阳性克隆获取其目的基因 [3] ,除 了免疫筛选方法外, 也可根据目的蛋白的生物学功能, 利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得, 但纯度较高时, 可利用其中的一段氨基酸序列, 反推出其基因序列, 据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选; 或根据所获得的基因序列, 指导5?? 端的引物合成, 根据mRNA3?? 端poly-A 序列指导合成poly-T 的3?? 端引物, 用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物物中合成相应的cDNA, 将该cDNA 克隆到表达载体上进行产物表。 1.2??同源性序列克隆技术?? 随着基因研究的不断深入, 人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系:生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理, 在其他种属同源基因被克隆的前提下, 构建cDNA 文库或基因组文库, 然后用已知分子高保守序列设计简并引物, 并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库进行PCR 扩增, 再对PCR 扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。 对于同源性很高的基因, 可以直接用作探针进行非严谨性杂交筛选另一物种的DNA 文库。如Funkenstein 等用红海鲷和红鳟鱼的生长激素(GH) 753 河南职工医学院学报 第22卷 基因的cDNA 筛选gsb 的cDNA 文库, 得到gsbGH 的cDNA 克隆[4] 。Almuly 等用gsbGH 的cDNA 筛 选gsb 的基因组文库, 进一步克隆了gsbGH 基因 [5] 。 同源性序列克隆技术自提出以来, 受到了国内外学者的广泛重视, 发展很迅速, 但有些问题是值得重视和思考的:!由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异, 简并引物的特异性要设计得当, 必要时需要设计几套引物组合。? 由于某些同源序列并不专属于某一基因家族, 因而扩增产物不一定是某一基因家族成员。#基因家族成员往往成簇存在, 克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。因此对PCR 扩增产物和克隆产物, 有必要进行基因与性状共分离分析, 插入失活或遗传转化等功能鉴定工作, 以便最终筛选到目的基因。2?? 表型克隆技术 细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下(如癌变、异常增生), 常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高, 而另一些基因可能表达降低或缺失, 因而分离差异表达基因将是认识生物体的生长发育等生命活动过程的入手点, 以此为基础, 才能深入理解基因的结构、功能、表达与调控。差异表达基
因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一化发展为多元化, 而且呈各种方法互相结合的趋势。 分离差异表达基因的3种基本方法为:差式筛选(differentialscreening)[6] 、扣除杂交(subtrac?? tionhybridization)[7-9] 、差异展示反转录PCR(differ?? entialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRT-PCR [10] )。差式筛选法是分别从有特异表达基因 的目标样(targetsample,TS)和无特异表达基因的参照样(referencesample)中提取mRNA, 反转录为cDNA, 并构建TS 的cDNA 文库, 分别将从TS 和RS 中提取mRNA 制成cDNA 探针, 分别用TS 和RS 的cDNA 探针与TScDNA 文库的菌落或噬菌斑作原位杂交, 选出只与TS 杂交, 而不与RS 杂交的克隆即为TS 特异表达的克隆。此法常要经过多轮菌斑杂交, 不仅费力费钱, 重复性差, 而且灵敏度很低。扣除杂交则是用TS 提取的mRNA 反转录成cDNA 探针与RS 的过量mRNA 或cDNA 杂交, 经两轮充分杂交后, 移去杂交分子和过量的RS 的mRNA 或cD?? NA,将不形成杂交体的TS 的cDNA 纯化富集, 扩增, 建立相应cDNA 文库即为差异表达基因cDNA 文库。但此法回收cDNA 量有限, 重复性差, 灵敏度低。DDRT-PCR 则是分别用TS 和RS 的总mRNA 作模板, 利用12个可能的锚定引物T11MN 锚定mRNA 的olyA 末端, 借助逆转录酶合成cDNA 第一链, 得mRNA/cDNA,再用相同的3?? 锚定引物和5?? 端随机引物分别扩增TS 、RS 的mRNA/cDNA,扩增产物用序列胶电泳分析差异表达情况, 将差异带DNA 回收, 可进一步鉴定分析, 最终获得差异表达基因。它与前二者相比, 速度快, 易操作, 可以鉴定低丰度差异表达的mRNA, 分析2种以上样品基因的差异表达等优点, 但仍存在假阳性率高、重复性差、扩增片段短等问题。下面就这些方法的具体过程作详细介绍。 2.1??代表性差示分析法(RDA)??该法可用于分离与生理条件改变相关的基因及不同发育阶段差异表达的基因, 具体过程个如下:!制备扩增子。提取TS 和RS 的mRNA 并反转录制备双链cDNA 即test??ercDNA 和drivercDNA 。然后用限制性内切酶切, 将酶切片段装上接头, 末端补平后, 加入接头引物进行PCR 扩增。? 扣除杂交。去除接头后仅对tester 片段加上新的接头, 用过量的drivercDNA 与之杂交退火, 将形成三种产物:tester/tester、tester/driver、driver/driver。#特异性片段的扩增。末端补平后, 加入新接头引物进行PCR 。3种产物中仅自身退火形成的tester/tester两端均能和新引物配对而呈指数扩增,tester/driver仅一端可和新引物配对而呈线性扩增,Driver/driver无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸酶去除单链DNA 分子, 再进行PCR 富集特异表达cDNA 片段。? 对特异片段进行克隆, 通过FISH 等技术进一步分离特异表达基因。2.2?? 抑制性差减杂交PCR 法(SSH)??SSH的基本流程如下:!第1次杂交。提取TS 和RS 的mRNA 反转录为testercDNA 和drivercDNA, 用RsaI 或Hae%酶切成平头末端cDNA, 分成均等2份, 分别加不同的接头, 再分别与过量的drivercDNA 杂交, 将形成4种产物:a,单链testercDNA 、b, 自身退火的tester/tester双链、c, 异源退火tester/driver双链、d,drivercDNA 。? 第2次杂交。合并2份杂交产物, 加入新的变性drivercDNA 退火、杂交, 这次除了a 、b 、c 、d4种产物外还形成产物e,e 是tester 自身退火 754 第6期刘心伟, 等?? 基因克隆技术研究进展 形成, 但两端带不同接头。#特异性片段的扩增。末端补平后, 先后加接头的内、外侧引物扩增,a 和d 无扩增,b 由于两端接头互补形成发夹结构也无扩增,c 仅一端有引物结合呈线性扩增, 仅e 两端可配不同引物而呈指数扩增。? 特异性片段e 克隆, 并进一步分离差异表达基因。 该法通过2次杂交和2次PCR, 使假阳性率可降到6% [11] , 且灵敏度高。用SSH 可一次同时分离 几十至几百个差异基因, 效率大增。 2.3??交互差减差异RNA 显示(RSDD)??RSDD的主要过程如下:!交互差减。分别提取具有差异表达的2种组织细胞A 、B 的mRNA, 反转录为cDNA, 并构建cDNA 文库。将这2个文库进行交互差减得到A 减B 和B 减A 的2个差减cDNA 文库, 由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构, 载体进入宿主后, 其上质粒载体被切下, 得质粒cDNA 文库。? 差异显示。用3?? 锚定引物和5?? 随机引物对2个差减文库提取的DNA 分别进行PCR 扩增, 将扩增产物用5%序列胶电泳, 显示并分离差异条带, 回收差异DNA, 再次扩增后, 获得富集的差异表达片段。#表达分析。采用反向Northern 分析和Northern 分析鉴定经再次扩增
的差异DNA 片段的真伪。反向Northern 分析是将差异显示得到的扩增后DNA 片段转膜, 分别与来自A 、B 细胞系的总mRNA 经反转录制备的32P 标记的cDNA 第一条链探针进行杂交, 只与亲本来源细胞系杂交, 而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因。? 对差异片段克隆、测序, 并进一步分离获得差异表达的基因。 RSSD可以有效快速地鉴定由于细胞生理变化而在基因组中差异表达的基因, 它结合了DDRT-PCR 和扣除杂交的优点, 减少或消除了共有序列, 使序列胶上条带清晰度增加, 并使低丰度序列得到富集, 降低了假阳性率, 且RSDD 仅用较少的引物进行逆转录PCR 就可分析全部差异表达基因, 但RSSD 并不能完全杜绝假阳性。Kang 等用RSDD 法克隆并证实了促进肿瘤发展的基因(PEGene)和抑制肿瘤发展的基因(PSGene)[12] 。 3?? 图位克隆技术 随着各种生物分子标记连锁图的相继建立和越来越多的基因被定位, 在90年代初图位克隆技术也 应运而生。其原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座, 在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上, 用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DAN 文库(如YAC 、BAC 或Cos??mid 文库), 构建出目的基因区域的物理图谱, 再通过染色体步行(chromosomewalking)逐步逼近候选区域或通过染色体登陆(chromosomelanding)的方法最终找到包含该目的基因的克隆进而克隆该基因。 定位克隆理论上适用于一切基因, 但也存在应用上的一些不足:如果要构建完整的基因组文库, 建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系, 对基因组较大、标记数量不多而重复序列较多的生物采用此法投资大且效率低, 因而图位克隆技术目前仅局限于拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和的模式植物上。 4??表达序列标签技术(EST) EST 是完整基因上能特异性标记基因的一部分序列, 通常包含了基因足够的结构信息区, 从而与其他基因相区分, 大规模EST 克隆和资料库的建立, 为利用生物信息学克隆基因提供了条件。其基本原理是从组织特异性或细胞特异性的DNA 文库中随机挑选克隆, 并进行5?? 和3?? 端部分测序, 通过对基因库的检索, 可以检测所测序以及翻译的多肽氨基酸序列与基因库中已知的是否有同源性, 最后对发现的新基因进行突变检测和表达分析。基本过程如下:!对已知的部分序列进行数据库分析, 筛选出代表新基因的EST 及相应的重叠群, 定位信息等, 根据所得信息设计引物, 制备探针。? 用探针进行cDNA 文库筛选, 得cDNA 阳性克隆, 接着用设计引物与所得cDNA 阳性克隆载体臂进行巢式PCR 和5?? 、3??-RACE, 得5?? 端和3?? 端部分序列(约400bp) 。#对所得阳性克隆和末端序列进行测序。? 通过数据库对新序列进行分析, 包括与已知基因的同源性分析、拼接延伸、ORF 识别、结构分析、翻译蛋白质分析等。&若第一步有新EST 的定位信息, 即可对基因进行定位和结构分析; 若无定位信息, 还要筛选基因组文库, 进行测序和FISH 定位等工作。? 最后对发现的新基因进行突变检测和表达分析。 该技术建立在大量已有的生物信息资源基础上的, 同时, 结合了目前的新技术, 为大规模克隆基因 755 河南职工医学院学报 第22卷 提供了捷径。它不仅可检测到许多已知的基因, 更可以发现许多未知的基因。 EST还具有广泛的用途。利用对独立EST 的拼接可获得新基因的全长cDNA 序列; 利用EST 标签克隆的斑点杂交可鉴定涉及组织或器官发育过程不同阶段各个基因表达的不同, 与其他差别杂交方法相比, 它能进行初步筛选和鉴定, 因而节省了时间; 由于事先获得了某个基因的EST, 所以可加速对该基因的克隆以及序列测定。 5??转座子标签(transposontagging)技术 转座子是染色体上一段可以移动的DNA 序列, 它可以从一个基因座位转移到另一个基因座位, 当转座子插入到某个功能基因内部或邻近位点时, 就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型, 通过遗传分析可以确定某基因的突变是否由转座子引起, 由转座子引起的突变可用转座子DNA 为探针, 从突变株的基因组文库中钓取含该转座子的DNA 片段, 获得含有部分突变株DNA 序列的克隆, 然后以该DNA 序列为探针, 筛选野生型植株的基因组文库, 最终得到完整的目的基因。该技术主要用于植物基因的克隆 [13] ,由于可供利用的转座子的种 类太少, 而转座子在不同的植物中转座的频率和活性相差很大, 并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体, 限制了转座子标签法的应用范围。 基因克隆的技术发展很快, 种类也越来越多, 但每一种方法都有它的优势和劣势及适用范围和限制因素。综合来看,
不同的克隆策略, 虽主导思路不同, 但常常是相互联系相互补充的, 有些过程也是共通的, 因而实验者必须根据所克隆基因的类型和实际条件选择最佳的方案。随着各种知识的积累, 克隆基因的技术也逐步完善, 速度效率也不断提高, 相信人类终将掌握大规模、快捷、[1]??李子银, 陈受宜. 植物的功能(基因组学研究进展[J].遗传, 经济基因克隆的技术, 并很快将基因的研究安全地应用到实践中去。参考文献: [
基因克隆技术研究进展
刘心伟1 ,朱文豪2 ,李?? 何 3 (1.河南省体育科学研究所, 河南郑州450044;2. 河南省农科院畜牧兽医研究所, 河南郑州450002; 3.信阳职业技术学院化学工程系, 河南信阳464000)
[关键词]??基因克隆; 图位克隆; 转座子标签; 表达序列标签; 差异表达基因 [中图分类号]??Q785????????[文献标识码]??B????????[文章编号]??1008-9276(2010)06-0753-04 ???? 几种模式生物基因组测序和人类基因组计划(humangenomeprojec,tHGP)的相继完成, 使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作和序列测定, 后基因组学时代则是进行基因组功能注释(genomeannotation),这也是功能基因组学的主要研究目标 [1-2] 。如何利用基因这一重要的资源, 日益成为研究焦点。关于基因专利权的建立和完善的基因争夺大战的硝烟也正在弥漫全球。克隆化基因不仅可以用来兴旺生命科学工业(制药业等), 改良农作物、畜禽品种等, 还可以对遗传性疾病进行基因治疗, 探索疾病的分子机制和生物发育调控规律。克隆基因的途径有两种, 正向遗传学和反向遗传学途径。前者是依据目标基因所表现的功能为基础, 通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的; 后者则着眼于基因本身, 通过特定的序列或在基因组中的位置进行。基因的克隆一般采用下列技术:同源序列技术、差异表达基因分离技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和转座子标签技术等。1?? 功能性克隆 1.1??通过基因产物的克隆技术?? 在传统遗传学(正向遗传学) 占主导地位的时代, 人们以基因产物为导向来分离克隆基因(功能克隆) 。由于基因产物的结构、功能已知, 可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列, 反推其核苷酸序列, 设计探针或引物从基因组DNA 文库或cDNA 文库中筛选克隆, 也可以制 备产物抗体, 从表达载体构建的cDNA 文库中筛选相应克隆, 进而分离目的基因。 若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时, 可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法, 筛选阳性克隆获取其目的基因 [3] ,除 了免疫筛选方法外, 也可根据目的蛋白的生物学功能, 利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得, 但纯度较高时, 可利用其中的一段氨基酸序列, 反推出其基因序列, 据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选; 或根据所获得的基因序列, 指导5?? 端的引物合成, 根据mRNA3?? 端poly-A 序列指导合成poly-T 的3?? 端引物, 用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物物中合成相应的cDNA, 将该cDNA 克隆到表达载体上进行产物表。 1.2??同源性序列克隆技术?? 随着基因研究的不断深入, 人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系:生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理, 在其他种属同源基因被克隆的前提下, 构建cDNA 文库或基因组文库, 然后用已知分子高保守序列设计简并引物, 并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库进行PCR 扩增, 再对PCR 扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。 对于同源性很高的基因, 可以直接用作探针进行非严谨性杂交筛选另一物种的DNA 文库。如Funkenstein 等用红海鲷和红鳟鱼的生长激素(GH) 753 河南职工医学院学报 第22卷 基因的cDNA 筛选gsb 的cDNA 文库, 得到gsbGH 的cDNA 克隆[4] 。Almuly 等用gsbGH 的cDNA 筛 选gsb 的基因组文库, 进一步克隆了gsbGH 基因 [5] 。 同源性序列克隆技术自提出以来, 受到了国内外学者的广泛重视, 发展很迅速, 但有些问题是值得重视和思考的:!由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异, 简并引物的特异性要设计得当, 必要时需要设计几套引物组合。? 由于某些同源序列并不专属于某一基因家族, 因而扩增产物不一定是某一基因家族成员。#基因家族成员往往成簇存在, 克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。因此对PCR 扩增产物和克隆产物, 有必要进行基因与性状共分离分析, 插入失活或遗传转化等功能鉴定工作, 以便最终筛选到目的基因。2?? 表型克隆技术 细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下(如癌变、异常增生), 常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高, 而另一些基因可能表达降低或缺失, 因而分离差异表达基因将是认识生物体的生长发育等生命活动过程的入手点, 以此为基础, 才能深入理解基因的结构、功能、表达与调控。差异表达基
因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一化发展为多元化, 而且呈各种方法互相结合的趋势。 分离差异表达基因的3种基本方法为:差式筛选(differentialscreening)[6] 、扣除杂交(subtrac?? tionhybridization)[7-9] 、差异展示反转录PCR(differ?? entialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRT-PCR [10] )。差式筛选法是分别从有特异表达基因 的目标样(targetsample,TS)和无特异表达基因的参照样(referencesample)中提取mRNA, 反转录为cDNA, 并构建TS 的cDNA 文库, 分别将从TS 和RS 中提取mRNA 制成cDNA 探针, 分别用TS 和RS 的cDNA 探针与TScDNA 文库的菌落或噬菌斑作原位杂交, 选出只与TS 杂交, 而不与RS 杂交的克隆即为TS 特异表达的克隆。此法常要经过多轮菌斑杂交, 不仅费力费钱, 重复性差, 而且灵敏度很低。扣除杂交则是用TS 提取的mRNA 反转录成cDNA 探针与RS 的过量mRNA 或cDNA 杂交, 经两轮充分杂交后, 移去杂交分子和过量的RS 的mRNA 或cD?? NA,将不形成杂交体的TS 的cDNA 纯化富集, 扩增, 建立相应cDNA 文库即为差异表达基因cDNA 文库。但此法回收cDNA 量有限, 重复性差, 灵敏度低。DDRT-PCR 则是分别用TS 和RS 的总mRNA 作模板, 利用12个可能的锚定引物T11MN 锚定mRNA 的olyA 末端, 借助逆转录酶合成cDNA 第一链, 得mRNA/cDNA,再用相同的3?? 锚定引物和5?? 端随机引物分别扩增TS 、RS 的mRNA/cDNA,扩增产物用序列胶电泳分析差异表达情况, 将差异带DNA 回收, 可进一步鉴定分析, 最终获得差异表达基因。它与前二者相比, 速度快, 易操作, 可以鉴定低丰度差异表达的mRNA, 分析2种以上样品基因的差异表达等优点, 但仍存在假阳性率高、重复性差、扩增片段短等问题。下面就这些方法的具体过程作详细介绍。 2.1??代表性差示分析法(RDA)??该法可用于分离与生理条件改变相关的基因及不同发育阶段差异表达的基因, 具体过程个如下:!制备扩增子。提取TS 和RS 的mRNA 并反转录制备双链cDNA 即test??ercDNA 和drivercDNA 。然后用限制性内切酶切, 将酶切片段装上接头, 末端补平后, 加入接头引物进行PCR 扩增。? 扣除杂交。去除接头后仅对tester 片段加上新的接头, 用过量的drivercDNA 与之杂交退火, 将形成三种产物:tester/tester、tester/driver、driver/driver。#特异性片段的扩增。末端补平后, 加入新接头引物进行PCR 。3种产物中仅自身退火形成的tester/tester两端均能和新引物配对而呈指数扩增,tester/driver仅一端可和新引物配对而呈线性扩增,Driver/driver无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸酶去除单链DNA 分子, 再进行PCR 富集特异表达cDNA 片段。? 对特异片段进行克隆, 通过FISH 等技术进一步分离特异表达基因。2.2?? 抑制性差减杂交PCR 法(SSH)??SSH的基本流程如下:!第1次杂交。提取TS 和RS 的mRNA 反转录为testercDNA 和drivercDNA, 用RsaI 或Hae%酶切成平头末端cDNA, 分成均等2份, 分别加不同的接头, 再分别与过量的drivercDNA 杂交, 将形成4种产物:a,单链testercDNA 、b, 自身退火的tester/tester双链、c, 异源退火tester/driver双链、d,drivercDNA 。? 第2次杂交。合并2份杂交产物, 加入新的变性drivercDNA 退火、杂交, 这次除了a 、b 、c 、d4种产物外还形成产物e,e 是tester 自身退火 754 第6期刘心伟, 等?? 基因克隆技术研究进展 形成, 但两端带不同接头。#特异性片段的扩增。末端补平后, 先后加接头的内、外侧引物扩增,a 和d 无扩增,b 由于两端接头互补形成发夹结构也无扩增,c 仅一端有引物结合呈线性扩增, 仅e 两端可配不同引物而呈指数扩增。? 特异性片段e 克隆, 并进一步分离差异表达基因。 该法通过2次杂交和2次PCR, 使假阳性率可降到6% [11] , 且灵敏度高。用SSH 可一次同时分离 几十至几百个差异基因, 效率大增。 2.3??交互差减差异RNA 显示(RSDD)??RSDD的主要过程如下:!交互差减。分别提取具有差异表达的2种组织细胞A 、B 的mRNA, 反转录为cDNA, 并构建cDNA 文库。将这2个文库进行交互差减得到A 减B 和B 减A 的2个差减cDNA 文库, 由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构, 载体进入宿主后, 其上质粒载体被切下, 得质粒cDNA 文库。? 差异显示。用3?? 锚定引物和5?? 随机引物对2个差减文库提取的DNA 分别进行PCR 扩增, 将扩增产物用5%序列胶电泳, 显示并分离差异条带, 回收差异DNA, 再次扩增后, 获得富集的差异表达片段。#表达分析。采用反向Northern 分析和Northern 分析鉴定经再次扩增
的差异DNA 片段的真伪。反向Northern 分析是将差异显示得到的扩增后DNA 片段转膜, 分别与来自A 、B 细胞系的总mRNA 经反转录制备的32P 标记的cDNA 第一条链探针进行杂交, 只与亲本来源细胞系杂交, 而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因。? 对差异片段克隆、测序, 并进一步分离获得差异表达的基因。 RSSD可以有效快速地鉴定由于细胞生理变化而在基因组中差异表达的基因, 它结合了DDRT-PCR 和扣除杂交的优点, 减少或消除了共有序列, 使序列胶上条带清晰度增加, 并使低丰度序列得到富集, 降低了假阳性率, 且RSDD 仅用较少的引物进行逆转录PCR 就可分析全部差异表达基因, 但RSSD 并不能完全杜绝假阳性。Kang 等用RSDD 法克隆并证实了促进肿瘤发展的基因(PEGene)和抑制肿瘤发展的基因(PSGene)[12] 。 3?? 图位克隆技术 随着各种生物分子标记连锁图的相继建立和越来越多的基因被定位, 在90年代初图位克隆技术也 应运而生。其原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座, 在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上, 用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DAN 文库(如YAC 、BAC 或Cos??mid 文库), 构建出目的基因区域的物理图谱, 再通过染色体步行(chromosomewalking)逐步逼近候选区域或通过染色体登陆(chromosomelanding)的方法最终找到包含该目的基因的克隆进而克隆该基因。 定位克隆理论上适用于一切基因, 但也存在应用上的一些不足:如果要构建完整的基因组文库, 建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系, 对基因组较大、标记数量不多而重复序列较多的生物采用此法投资大且效率低, 因而图位克隆技术目前仅局限于拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和的模式植物上。 4??表达序列标签技术(EST) EST 是完整基因上能特异性标记基因的一部分序列, 通常包含了基因足够的结构信息区, 从而与其他基因相区分, 大规模EST 克隆和资料库的建立, 为利用生物信息学克隆基因提供了条件。其基本原理是从组织特异性或细胞特异性的DNA 文库中随机挑选克隆, 并进行5?? 和3?? 端部分测序, 通过对基因库的检索, 可以检测所测序以及翻译的多肽氨基酸序列与基因库中已知的是否有同源性, 最后对发现的新基因进行突变检测和表达分析。基本过程如下:!对已知的部分序列进行数据库分析, 筛选出代表新基因的EST 及相应的重叠群, 定位信息等, 根据所得信息设计引物, 制备探针。? 用探针进行cDNA 文库筛选, 得cDNA 阳性克隆, 接着用设计引物与所得cDNA 阳性克隆载体臂进行巢式PCR 和5?? 、3??-RACE, 得5?? 端和3?? 端部分序列(约400bp) 。#对所得阳性克隆和末端序列进行测序。? 通过数据库对新序列进行分析, 包括与已知基因的同源性分析、拼接延伸、ORF 识别、结构分析、翻译蛋白质分析等。&若第一步有新EST 的定位信息, 即可对基因进行定位和结构分析; 若无定位信息, 还要筛选基因组文库, 进行测序和FISH 定位等工作。? 最后对发现的新基因进行突变检测和表达分析。 该技术建立在大量已有的生物信息资源基础上的, 同时, 结合了目前的新技术, 为大规模克隆基因 755 河南职工医学院学报 第22卷 提供了捷径。它不仅可检测到许多已知的基因, 更可以发现许多未知的基因。 EST还具有广泛的用途。利用对独立EST 的拼接可获得新基因的全长cDNA 序列; 利用EST 标签克隆的斑点杂交可鉴定涉及组织或器官发育过程不同阶段各个基因表达的不同, 与其他差别杂交方法相比, 它能进行初步筛选和鉴定, 因而节省了时间; 由于事先获得了某个基因的EST, 所以可加速对该基因的克隆以及序列测定。 5??转座子标签(transposontagging)技术 转座子是染色体上一段可以移动的DNA 序列, 它可以从一个基因座位转移到另一个基因座位, 当转座子插入到某个功能基因内部或邻近位点时, 就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型, 通过遗传分析可以确定某基因的突变是否由转座子引起, 由转座子引起的突变可用转座子DNA 为探针, 从突变株的基因组文库中钓取含该转座子的DNA 片段, 获得含有部分突变株DNA 序列的克隆, 然后以该DNA 序列为探针, 筛选野生型植株的基因组文库, 最终得到完整的目的基因。该技术主要用于植物基因的克隆 [13] ,由于可供利用的转座子的种 类太少, 而转座子在不同的植物中转座的频率和活性相差很大, 并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体, 限制了转座子标签法的应用范围。 基因克隆的技术发展很快, 种类也越来越多, 但每一种方法都有它的优势和劣势及适用范围和限制因素。综合来看,
不同的克隆策略, 虽主导思路不同, 但常常是相互联系相互补充的, 有些过程也是共通的, 因而实验者必须根据所克隆基因的类型和实际条件选择最佳的方案。随着各种知识的积累, 克隆基因的技术也逐步完善, 速度效率也不断提高, 相信人类终将掌握大规模、快捷、[1]??李子银, 陈受宜. 植物的功能(基因组学研究进展[J].遗传, 经济基因克隆的技术, 并很快将基因的研究安全地应用到实践中去。参考文献: [